蛋白质修饰#

在细胞质基质中发生蛋白质修饰的类型主要有:

1. 辅酶或辅基与酶的共价结合: 在无数酶促氧化-还原反应中, 细胞内的辅酶将能量以氢原子的形式在酶之间传递。
2. 磷酸化与去磷酸化: 用以调节细胞内多种蛋白质的生物活性, 进而快速影响细胞代谢。蛋白质磷酸化与去磷酸化影响细胞信号调控级联反应和基因转录活性。
3. 蛋白质糖基化作用: 糖基化主要发生在内质网和高尔基体中, 是指在蛋白质合成的同时或合成后, 在酶的催化下寡糖链被连接在肽链特定的糖基化位点, 形成糖蛋白。在细胞质基质中发生的糖基化在哺乳动物的细胞中主要是把 N-乙酰葡糖胺加到蛋白质的丝氨酸残基的羟基上。蛋白质糖基化修饰对蛋白质折叠、分选及其定位, 糖链结构不同还将影响糖蛋白的半寿期和降解。
4. 甲基化修饰: 很多细胞骨架蛋白其 N 端发生甲基化修饰, 以防止被细胞内的蛋白质水解酶降解, 从而使蛋白质在细胞中维持较长的寿命。组蛋白甲基化修饰在细胞内由特异性的甲基转移酶催化完成, 主要包括精氨酸甲基化和赖氨酸甲基化两种情况, 组蛋白甲基化修饰既可抑制也可增强基因表达。
5. 酰基化: 最常见的一类酰基化的修饰是内质网上合成的跨膜蛋白在通过内质网和高尔基体的转运过程中发生的, 由不同的酶催化软脂酸链共价连接到某些跨膜蛋白暴露在细胞质基质侧的结构域上。另一类酰基化修饰发生在诸如 src 基因和 ras 基因这类癌基因的表达产物上, 催化这一反应的酶可识别蛋白质中的信号序列, 将脂肪酸链共价地结合到蛋白质特定的位点上。

控制蛋白质的寿命#

泛素化降解途径(ubiquitin mediated pathway): 在真核细胞的细胞质基质中, 有一种识别并降解错误折叠或不稳定蛋白质的机制, 即泛素化和蛋白酶体所介导的蛋白质降解途径, 泛素化和蛋白酶体所介导的蛋白质降解途径具有多种生物学功能: 包括蛋白质质量监控、影响细胞代谢、信号转导和受体调整、免疫反应、细胞周期、转录调节和 DNA 修复等；

蛋白酶体(proteasome): 是细胞内降解蛋白质的大分子复合体, 由约 50 种蛋白质亚基组成, 富含 ATP 依赖的蛋白酶活性, 功能好似细胞内蛋白质破碎机。

泛素(ubiquitin): 是由 76 个氨基酸残基组成小分子球蛋白, 具热稳定性, 普遍存在于真核细胞中, 广泛存在且序列高度保守, 故名泛素。在蛋白质降解过程中, 多个泛素分子共价结合到含有不稳定氨基酸残基的蛋白质的 N 端, 然后带有泛素化标签的蛋白质被蛋白酶体识别并降解。

泛素化过程涉及如下步骤:

1. 泛素活化酶(E1)通过形成酰基-腺苷酸中介物使泛素分子 C 端被激活, 该反应需要 ATP;
2. 转移活化的泛素分子与泛素结合酶(E2)的半胱氨酸残基结合;
3. 异肽键形成, 即与 E2 结合的泛素羧基和靶蛋白赖氨酸侧链的氨基之间形成异肽键, 该反应由泛素连接酶(E3)催化完成。重复上述步骤, 形成具有寡聚泛素链的泛素化靶蛋白。

泛素化标签被蛋白酶体帽识别, 并利用 ATP 水解提供的能量驱动泛素分子的切除和靶蛋白解折叠, 去折叠的蛋白质转移至蛋白酶体核心腔内被降解。

当泛素化的靶蛋白其泛素自身的赖氨酸残基也被泛素化时, 便形成具有寡聚泛素链的泛素化的蛋白。靶蛋白不同位点赖氨酸残基的泛素化修饰产生不同的生理效应,

靶蛋白 Lys48 残基修饰的泛素化靶蛋白导致被蛋白酶体降解,靶蛋白 Lys63 位点的泛素化修饰可能导致蛋白质活性的改变(活化或失活)。

通过该途径降解的蛋白质包括两类:

• 一是错误折叠或异常的蛋白
• 二是需要进行存量调控和不稳定的蛋白质。

蛋白质的泛素化需要多酶复合体发挥作用, 即通过 3 种酶的先后催化来完成, 包括泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。

降解变性和错误折叠的蛋白质#

细胞质基质中的变性蛋白质、错误折叠的蛋白质、含有被氧化或其他非正常修饰氨基酸的蛋白质, 不管其 N 端氨基酸残基是否稳定, 也常常很快被降解清除。

帮助变性或错误折叠的蛋白质重新折叠, 形成正确的分子构象#

这一功能主要靠热休克蛋白来完成。

热休克蛋白(heat shock protein,HSP): 是一类进化上高度保守的蛋白质家族, 在人类、果蝇和植物中发现的 HSPs 都有相似的序列和功能, 它们作为分子伴侣而发挥多种作用, 协助细胞内蛋白质合成、分选、折叠与装配等。在正常细胞中, 热休克蛋白选择性地与畸形蛋白质结合形成聚合物, 利用水解 ATP 释放的能量使聚集的蛋白质溶解, 并进一步折叠成正确构象的蛋白质。

蛋白质的合成是糙面内质网的主要功能#

细胞中的蛋白质都是在核糖体上合成的, 并都是起始于细胞质基质游离核糖体。有些蛋白质刚起始合成不久便转移至内质网膜上, 继续肽链延伸并完成蛋白质合成。在糙面内质网上, 多肽链边延伸边穿过内质网膜进入内质网腔中, 以这类方式合成的蛋白质主要包括:

1. 向细胞外分泌的蛋白质: 这类蛋白质常以分泌泡的形式通过细胞的胞吐作用输送到细胞外。
2. 膜的整合蛋白: 细胞质膜上的膜蛋白及内质网、高尔基体和溶酶体膜上的膜蛋白, 其构象都具有方向性, 并且在内质网上合成时就已确定, 在后续的转运过程中, 其拓扑学特性始终保持不变。
3. 细胞器中的可溶性驻留蛋白: 在合成后进入内质网腔, 然后再进一步包装分选。

光面内质网是脂质合成的重要场所#

内质网合成细胞所需包括磷脂和胆固醇在内的几乎全部膜脂, 其中最主要的磷脂是磷脂酰胆碱(卵磷脂)。合成磷脂所需要的 3 种酶都定位在内质网膜上, 其活性部位在膜的细胞质基质侧。

蛋白质的修饰与加工#

在糙面内质网合成的膜蛋白和可溶性分泌蛋白在它们分选各就各位之前, 通常要发生 4 种基本修饰与加工:

1. 发生在内质网和高尔基体的蛋白质糖基化
2. 在内质网发生二硫键的形成
3. 蛋白质折叠和多亚基蛋白的装配
4. 在内质网、高尔基体和分泌泡发生特异性的蛋白质水解切割

新生多肽的折叠与组装#

肽链的合成仅需几十秒钟至几分钟即可完成, 而新合成的多肽在内质网停留的时间往往长达几十分钟, 取决于蛋白质正确折叠所需要的时间。有些多肽还要进一步参与多亚基寡聚体的组装。不能正确折叠的畸形肽链或未组装成寡聚体的蛋白质亚基, 一般都不能进入高尔基体, 内质网是蛋白质分泌转运途径中行使质量监控的重要场所。

蛋白质错误折叠引起的疾病:

1. 正确折叠和转运的蛋白质减少, 无法保障功能需求, 即功能丢失(loss of function)
2. 错误折叠蛋白质可以异常地获得功能(gain of function)

内质网其他功能#

肝细胞中光面内质网的解毒功能、肌细胞中特化的光面内质网——肌质网、参与胆固醇和固醇类激素的合成;储存 Ca2+, 作为细胞内信号物质、提供酶附着的位点和机械支撑作用、内质网-细胞核信号转导途径。

高尔基体顺面膜囊与顺面网状结构(cis Golgi network, CGN)#

• 顺面膜囊位于高尔基体顺面外侧, 顺面网状结构(CGN)与之相连, 呈中间多孔而连续分支状。
• CGN 膜厚约 6nm，比高尔基体其他部位略薄，但与内质网膜厚度接近。
• 一般认为，CGN 接受来自内质网新合成的物质并将其分类后大部分转入高尔基体中间膜囊，少部分蛋白质与脂质再返回内质网。返回内质网的蛋白质具有 KDEL(或 HDEL)信号序列，它是内质网驻留蛋白的特有序列。
• CGN 区域还可能具有其他生物活性，如蛋白质丝氨酸残基发生 0-连接的糖基化，跨膜蛋白在细胞质基质一侧结构域的酰基化，溶酶体酶上寡糖的磷酸化日冕病毒的装配也发生在 CGN

高尔基体中间膜囊(medial Golgi)#

• 中间膜囊位于顺面膜囊与反面膜囊之间，由扁平膜囊与管道组成，形成不同间隔，但功能上是连续的、完整的膜囊体系。
• 多数糖基修饰与加工、糖脂的形成以及与高尔基体有关的多糖的合成都发生在中间膜囊。
• 扁平膜囊特殊的形态大大增加了糖的合成与修饰的有效表面积。

高尔基体反面膜囊与反面网状结构(trans Golgi network, TGN)#

• 反面膜囊位于高尔基体反面外侧，反面网状结构(TGN)与之相连，外侧伸入反面侧细胞质中，形态呈管网状。
• TGN 内 pH 可能比高尔基体其他部位低。TGN 是高尔基体蛋白质分选的枢纽区，同时也是蛋白质包装形成网格蛋白/AP 包被膜泡的重要发源地之一。
• 此外，某些“晚期”的蛋白质修饰也发生在 TGN，如半乳糖 a-2,6 位的唾液酸化、蛋白质酪氨酸残基的硫酸化及蛋白原的水解加工作用等。

高尔基体与细胞的分泌活动#

分泌性蛋白在细胞内的合成与转运过程是通过高尔基体来完成的, 多种细胞质膜上的膜蛋白、溶酶体中的酸性水解酶及胶原等胞外基质成分, 其定向转运过程都是通过高尔基体完成的。

高尔基体 TGN 区是蛋白质包装分选的关键枢纽, 在这里至少有 3 条分选途径: 溶酶体酶的包装与分选途径、可调节性分泌途径、组成型分泌途径。

在一种称为 I 细胞病(inclusion cell disease)的病人中,由于 N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶单基因的突变, 因此不能合成甘露糖-6-磷酸, 溶酶体的酶也就不能被受体识别, 因而无法转运到溶酶体中。

蛋白质的糖基化及其修饰#

大多数蛋白质或膜脂的糖基化修饰和与高尔基体有关的多糖的合成, 主要发生在高尔基体。

两种糖基化过程

1. N-连接的糖基化过程: 反应起始发生在糙面内质网, 一个由 14 个糖残基的寡糖链从供体磷酸多萜醇上转移至新生肽链的特定三肽序列的天冬酰胺残基上。N-连接的寡糖链都有一个共同的前体, 在糙面内质网以及在通过高尔基体各膜囊间隔的转移过程中, 寡糖链经过一系列加工、切除和添加特定的单糖, 最后形成成熟的糖蛋白。所有成熟的 N-连接的寡糖链都含有 2 个 N-乙酰葡糖胺和 3 个甘露糖残基。
2. O-连接的糖基化过程: 是在高尔基体中进行的。由不同的糖基转移酶催化, 每次加上一个单糖。最后一步是加上唾液酸残基, 这一反应发生在高尔基体反面膜囊和 TGN 中, 至此完成全部糖基的加工与修饰。

蛋白质糖基化的生物学功能(意义)

• 糖基化的蛋白质其寡糖链具有促进蛋白质折叠和增强糖蛋白稳定性的作用。
• 蛋白质糖基化修饰使不同蛋白质携带不同的标志, 以利于在高尔基体进行分选与包装, 保证糖蛋白从糙面内质网至高尔基体膜囊单向转移。
• 细胞表面、细胞外基质密集存在的寡糖链, 可通过与另一个细胞表面的凝集素之间发生特异性相互作用, 直接介导细胞间的双向通讯, 或参与分化、发育等多种过程。
• 多羟基糖侧链还可能影响蛋白质的水溶性及蛋白质所带电荷的性质 3.蛋白酶的水解和其他加工过程

有些多肽, 在糙面内质网中切除信号肽后便成为有活性的成熟多肽。不同的蛋白质在高尔基体中酶解加工的方式各不相同, 可归纳为以下几种类型:

1. 没有生物活性的蛋白原进入高尔基体后, 将蛋白原 N 端或两端的序列切除形成成熟的多肽。
2. 有些蛋白质分子在糙面内质网合成时是含有多个相同氨基酸序列的前体, 然后在高尔基体中被水解形成同种有活性的多肽。
3. 一个蛋白质分子的前体中含有不同的信号序列, 最后加工形成不同的产物。

溶酶体膜在成分与其他生物膜不同之处:#

1. 嵌有质子泵, 利用 ATP 水解释放的能量将 H+泵入溶酶体内, 使溶酶体中的 H+浓度比细胞质中高 100 倍以上, 以形成和维持酸性的内环境;
2. 具有多种载体蛋白用于水解产物向外转运;
3. 膜蛋白高度糖基化, 可能有利于防止自身膜蛋白的降解, 以保持其稳定。

异质性(heterogeneous): 这是指不同的溶酶体或过氧化物酶体的形态大小, 甚至其中所含水解酶的种类以及形式的功能都可能有很大的不同。

溶酶体的类型:#

根据溶酶体处于完成其生理功能的不同阶段, 大致可分为初级溶酶体、次级溶酶体和残质体。

1. 初级溶酶体(primary lysosome): 是一种处于不同生理功能阶段之一的溶酶体, 呈球形, 内容物均不含有明显的颗粒物质, 外面由一层脂蛋白膜围绕, 其中的酶处于非活性状态。如果从细胞的分泌活动考虑, 初级溶酶体是一种刚刚分泌的含有溶酶体酶的分泌小泡。
2. 次级溶酶体(secondary lysosome): 是一种处于不同生理功能阶段之一的溶酶体, 此类溶酶体中含有水解酶和相应的底物, 正在进行或完成消化作用, 形状不规则, 可能包含多种生物大分子、细胞器、细菌等, 成分非常复杂。根据所消化的物质来源不同, 分为自噬性溶酶体、异噬性溶酶体。
   1. 自噬溶酶体(autophagolysosome): 是一种与自噬泡形成的复合体, 作用底物是内源性的,即细胞内的蜕变、破损的某些细胞器或局部细胞质。这种溶酶体广泛存在于正常的细胞内, 在细胞内起”清道夫”作用, 作为细胞内细胞器和其它结构降解和更新的正常途径。在组织细胞受到各种理化因素伤害时, 自噬性溶酶体大量增加, 因此对细胞的损伤起一种保护作用。
   2. 异噬溶酶体(heterophagic lysosome): 又称为异体吞噬泡, 它的作用底物是外源性的, 即细胞经吞噬、胞饮作用所摄入的胞外物质。异噬性溶酶体实际上是初级溶酶体同内吞泡融合后形成的。
3. 残质体(residual body): 吞噬体在溶酶体的作用下水解消化, 最终不能被消化的残余部分留在溶酶体所形成的一种结构。残质体内的物质最终以胞吐的方式排出细胞。

清除无用的生物大分子、衰老的细胞器及衰老损伤和死亡的细胞#

1. 清除暂时不需要的酶或某些代谢产物。细胞处于不同分化阶段及不同生理状态下, 都需要一系列特定的酶系统以维系正常的代谢活动, 细胞生理状态的变化常常是通过酶系统的改变而实现的。
2. 细胞中的生物大分子及细胞器都有一定的半寿期, 细胞质膜也处在不断的更新之中, 通过溶酶体的消化作用不断地清除衰老的细胞器和生物大分子, 是保障细胞正常代谢活动与调控所必需的。
3. 清除在发育中和成体中凋亡的细胞。这些任务主要由溶酶体和蛋白酶体共同承担, 所以溶酶体起着”清道夫”的作用。对衰老细胞的清除主要是由巨噬细胞完成。

防御功能#

防御功能是某些细胞特有的功能, 它可以识别并吞噬入侵的病毒或细菌, 在溶酶体作用下将其杀死并进一步降解。

其他重要的生理功能#

1. 作为细胞内的消化”器官” 为细胞提供营养, 饥饿状态下, 溶酶体可分解细胞内的生物大分子即自噬作用, 以保证机体所需的能量。
2. 在分泌腺细胞中, 溶酶体常常摄入分泌颗粒, 参与分泌过程的调节。
3. 无尾两栖类发育过程中蝌蚪尾巴的退化, 哺乳动物断奶后乳腺的退行性变化等都涉及某些特定细胞程序性死亡, 死亡后的细胞被周围吞噬细胞溶酶体消化清除。
4. 在受精过程中的顶体反应, 精子的顶体相当于特化的溶酶体, 其中含多种水解酶类, 能溶解卵细胞的外被及滤泡细胞, 产生孔道, 使精子进人卵细胞。

M6P 依赖性途径(溶酶体的发生)#

(1)溶酶体酶是在糙面内质网上合成并经 N-连接的糖基化基础修饰；
(2)然后转至高尔基体, 在高尔基体的 cis 面膜囊中寡糖链上的甘露糖残基被磷酸化形成甘露糖-6-磷酸(M6P)；
(3)在高尔基体的 trans 面膜囊和 TGN 膜上存在 M6P 的受体, 由于溶酶体酶的多个位点上都可形成 M6P, 从而大大增加了与受体的亲和力, 这种特异的亲和力使溶酶体酶与其他蛋白质分离并起到局部浓缩的作用, 这样溶酶体酶就与其他蛋白质区分开来；
(4)最后以出芽的方式形成网格蛋白/AP 包被膜泡转运到前溶酶体中。

M6P 受体的循环利用 受体穿梭于高尔基体和前溶酶体之间。在高尔基体的中性环境中, M6P 受体与 M6P 结合, 进入前溶酶体的酸性环境中后, 其膜上的 H ＋泵, 使内部呈酸性环境, 引起 M6P 受体与 M6P 分离, 并返回高尔基体。

一部分含有 M6P 标志的溶酶体酶会通过转运膜泡直接分泌到细胞外。在细胞质膜上, 存在依赖于 Ca2+的 M6P 受体, 它同样可与胞外的溶酶体酶结合, 在网格蛋白/AP 协助下通过受体介导的内吞作用, 将酶送至前溶酶体中, M6P 受体也同样可返回细胞质膜, 循环使用。

不依赖 M6P 的途径#

某些酶还可能通过不同的渠道进入溶酶体中, 如酸性磷酸酶, 合成时是一种跨膜蛋白, 它并不涉及 M6P 途径, 而是经高尔基体转运到细胞表面, 依赖于胞质侧部分酪氨酸残基信号, 从细胞表面再转运到溶酶体。

信号斑(signal patch): 信号斑是由几段信号肽形成的一个三维结构的表面, 这几段信号肽聚集在一起形成一个斑点, 被磷酸转移酶识别。信号斑是溶酶体酶的特征性信号。

前溶酶体(prelysosome): 前溶酶体的基本特征是脂蛋白膜上具有质子泵, 腔内呈酸性, pH6.0 左右。

动物细胞#

1. 过氧化物酶体可降解生物大分子, 其中常含有两种酶:一是依赖于黄素(FAD)的氧化酶, 其作用是将底物氧化形成 H2O2;二是过氧化氢酶, 其含量常占过氧化物酶体蛋白质总量的 40%, 它的作用是将 H2O2 分解, 形成水和氧气。由这两种酶催化的反应, 相互偶联, 从而使细胞免受 H2O2 的毒害。
2. 过氧化物酶体另一种功能是分解脂肪酸等高能分子向细胞直接提供热能, 而不必通过水解 ATP 的途径获得能量。

植物细胞#

1. 在绿色植物叶肉细胞中, 它催化 CO2 固定反应的副产物的氧化, 即所谓光呼吸作用；
2. 在种子萌发过程中, 过氧化物酶体降解储存在种子中的脂肪酸产生乙酰辅酶 A, 并进一步形成琥珀酸, 后者离开过氧化物酶体进一步转变成葡萄糖。