❗时空组学数据基本处理流程与原理-从 reads 到表达矩阵#

reference#

• 输入文件
  • 基因组序列文件: genome.fa
  • 基因注释文件: genes.gtf$/$gff

1
.
2
└── specieName
3
    ├── STAR_SJ100
4
    │   ├── Genome
5
    │   ├── SA
6
    │   ├── SAindex
7
    │   ├── chrLength.txt
8
    │   ├── chrName.txt
9
    │   ├── chrNameLength.txt
10
    │   ├── chrStart.txt
11
    │   ├── exonGeTrInfo.tab
12
    │   ├── exonInfo.tab
13
    │   ├── geneInfo.tab
14
    │   ├── genomeParameters.txt
15
    │   ├── sjdbInfo.txt
16
    │   ├── sjdbList.fromGTF.out.tab
17
    │   ├── sjdbList.out.tab
18
    │   └── transcriptInfo.tab
19
    ├── genes
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    │   └── genes.gtf
21
    └── genome
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        └── genome.fa
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4 directories, 17 files

• 输出文件
  • 参考基因组索引目录: /path/to/genomeDir
• 检查索引文件的小工具
  • SAW: checkGTF
• 参考脚本: example script

mask#

• 格式: *.h5

image#

• 格式:
  • SN*.ipr
  • SN*.tar.gz

fastq#

PE format

• read1 = CID + MID
• read2 = mRNA
• 不需要 splitMask SE format
• read_name = CID + MID
• read = mRNA
• 需要 splitMask

mapping 比对#

• Step1 BarcodeMapping: 原始测序读取（存储在 FASTQ 文件中）的 CID 与 Stereo-seq Chip T MASK 文件中保存的 CID-坐标键值对记录进行匹配（允许 1 个错配）。根据 MASK 文件中的记录，为可以配对的读取添加坐标信息。获得坐标注释的读取被称为有效 CID mRNA 读取（有效 CID 读取）。
• Step2 Filtering:
  • 丢弃不合格的 MID 读取（不满足进一步分析要求）
  • 过滤含有接头 adapter 的读取
  • 过滤长度(去除 poly-A 后)小于 30 的短读取
• Step3 GenomeMapping: mRNA 比对到参考物种基因组 输出文件:
• BAM 格式比对结果文件:
  • *.Aligned.sortedByCoord.out.bam
  • tag 列包含每条 reads 的空间位置信息
• 比对结果数据统计文件
  • *_barcodeMap.stat: BarcodeMapping 信息
  • *.Log.final.out: GenomeMapping 信息
  • *.barcodeReadsCount.txt: 每个 barcode 的 reads 数

merge 合并#

count 注释#

输出文件

• BAM 格式比对结果文件与 GEF 格式表达矩阵
  • *.Aligned.sortedByCoord.out.merge.q10.deduo.target.bam, Tag 列新增了注释成功的基因信息
  • .raw.gef, 基因表达矩阵
• 日志文件
  • logs/Bam2Gem_data_time.log, 记录了被跳过的基因

register/rapidRegister (图像)配准#

基于空间位置信息, 将影像图最优映射到基因表达矩阵上 配准逻辑:

• 基于 TrackLine 配准
  • 选模板(scale & rotation)
  • 根据模板推全局
• 算法原理
  • 重心法
• 修正/微调
  • 根据 TrackLine 进行微调

tissueCut 组织分隔#

在影像图上获取组织边界

• 有 ssDNA 图像: 基于影像图分隔
• 无 ssDNA 图像: 基于表达矩阵分隔 基于组织分隔掩模图, 结合矩阵进行组织区域表达矩阵提取, 输出 SN.tissue.gef

spatialCluster 空间聚类#

筛选高变菊英后进行 PCA 和 UMAP 降维, 再使用 Leiden 等算法进行聚类分析

saturation 饱和度计算#

根据饱和度曲线判断数据是否需要加测

report 报告输出#