arriba 使用笔记 - Lihuax's Blog

03 Workflow#

Arriba 基于 STAR，不改变常规比对结果；一次 STAR 比对即可同时获得常规 RNA-seq 比对和融合检测所需的嵌合比对。相比常规比对只增加少量运行时间。

流程分两步：

STAR 开启嵌合比对。必需设置 --chimSegmentMin，并推荐 --chimOutType WithinBAM，使嵌合片段作为 supplementary alignment 写入主 BAM。旧版 STAR 或 SeparateSAMold 模式会将其写到独立的 Chimeric.out.sam；Arriba 可用 -c 读取，但此模式已不推荐。
Arriba 从 supplementary alignments、discordant mates，以及跨越注释基因边界的比对中提取证据，再应用过滤器，分别写出通过过滤的融合和被过滤的候选。

STAR 推荐参数（需 STAR 2.7.6a 或更新版本）：

1
--outFilterMultimapNmax 50 \
2
--peOverlapNbasesMin 10 \
3
--alignSplicedMateMapLminOverLmate 0.5 \
4
--alignSJstitchMismatchNmax 5 -1 5 5 \
5
--chimSegmentMin 10 \
6
--chimOutType WithinBAM HardClip \
7
--chimJunctionOverhangMin 10 \
8
--chimScoreDropMax 30 \
9
--chimScoreJunctionNonGTAG 0 \
10
--chimScoreSeparation 1 \
11
--chimSegmentReadGapMax 3 \
12
--chimMultimapNmax 50

Arriba 不要求 BAM 排序或索引。为了节省时间，可将 STAR 输出直接 pipe 给 Arriba；STAR 输出未压缩 BAM 能避免压缩成为多线程运行瓶颈。下面是 paired-end FASTQ 的示例，路径和线程数按实际情况替换：

1
STAR \
2
  --runThreadN 8 \
3
  --genomeDir /path/to/STAR_index --genomeLoad NoSharedMemory \
4
  --readFilesIn read1.fastq.gz read2.fastq.gz --readFilesCommand zcat \
5
  --outStd BAM_Unsorted --outSAMtype BAM Unsorted \
6
  --outSAMunmapped Within --outBAMcompression 0 \
7
  --outFilterMultimapNmax 50 --peOverlapNbasesMin 10 \
8
  --alignSplicedMateMapLminOverLmate 0.5 \
9
  --alignSJstitchMismatchNmax 5 -1 5 5 \
10
  --chimSegmentMin 10 --chimOutType WithinBAM HardClip \
11
  --chimJunctionOverhangMin 10 --chimScoreDropMax 30 \
12
  --chimScoreJunctionNonGTAG 0 --chimScoreSeparation 1 \
13
  --chimSegmentReadGapMax 3 --chimMultimapNmax 50 \
14
| arriba \
15
  -x /dev/stdin -o fusions.tsv -O fusions.discarded.tsv \
16
  -a /path/to/assembly.fa -g /path/to/annotation.gtf \
17
  -b /path/to/blacklist.tsv.gz \
18
  -k /path/to/known_fusions.tsv.gz \
19
  -t /path/to/known_fusions.tsv.gz \
20
  -p /path/to/protein_domains.gff3

示例中 -k 和 -t 共用已知融合表：-k 用于对已知融合采用更灵敏的过滤，-t 用于在结果 tags 列标记它们。也可以分别提供不同文件。Arriba 附带的 run_arriba.sh 用于展示流程组件如何配合，并非完整生产流水线：它刻意省略错误检查、输入验证和接头/质量修剪等步骤。

04 Input files#

比对文件#

-x 指向 STAR 主比对文件（SAM/BAM/CRAM）。使用 --chimOutType WithinBAM 时主文件已含 Arriba 所需信息；使用 SeparateSAMold 时，还需通过 -c 传入 Chimeric.out.sam。Arriba 使用三类证据：split reads（STAR supplementary alignments）、discordant mate pairs，以及跨越注释基因边界的比对。最后一类让 Arriba 能在不调低 STAR --alignIntronMax 的情况下识别可能由局部缺失产生的融合，避免损害常规剪接比对。

文件无需排序，但排序后的 BAM 更便于压缩和在 IGV 中检查。SAM、BAM、CRAM、单端、双端以及混合数据均可处理，Arriba 按每条 read 的 BAM_FPAIRED 标志判断类型。

参考基因组与注释#

-a：参考基因组 FASTA，可 gzip 压缩。处理 CRAM 时需有对应 .fai。参考坐标必须与比对和注释一致。Wiki 支持坐标体系包括 hg19/GRCh37、hg38/GRCh38、mm10/GRCm38、mm39/GRCm39；自定义文件需坐标兼容。
-g：基因注释 GTF，可 gzip 压缩，无需排序。用于断点基因注释、剪接位点敏感度、转录本距离和融合方向判定。推荐 GENCODE 或 ENSEMBL；RefSeq 剪接位点和免疫球蛋白/TCR 位点注释较不完整。
download_references.sh 可列出或下载 Arriba 提供的参考文件。

Blacklist、已知融合、标签和蛋白结构域#

-b blacklist 强烈建议提供；缺少它可能使假阳性率增加一个数量级。安装包中的文件位于 database/blacklist_*。它用于去除重复比对伪影和健康组织中常见转录本（如 read-through、环状 RNA、非经典剪接）。TSV 两列，可 gzip；# 开头为注释。区域可写基因名、CONTIG:POSITION、CONTIG:START-END，也可给坐标加链方向；contig 名尾部 * 可匹配近似名称。第二列特殊值包括 any、split_read_donor、split_read_acceptor、split_read_any、discordant_mates、low_support、filter_spliced、not_both_spliced、read_through，用于按证据类型/方向或剪接条件屏蔽事件。具体语义见 Blacklist 说明。
-k 已知融合表用于对指定基因对提高灵敏度。文件两列，指定 5’ 与 3’ 基因/区域；顺序重要。被救回的候选可能为低置信度，灵敏度提高可能带来假阳性。安装包文件在 database/known_fusions_*。
-t 标签表三列：区域 1、区域 2、标签。匹配结果会把标签写入 tags 列。区域写法同上，顺序表示融合 5’ 和 3’ 端。已知融合文件通常可同时用于 -k、-t。
-p 蛋白结构域 GFF3（可 gzip），将保留结构域写入 retained_protein_domains。第九列至少含 Name=...;gene_id=...;gene_name=...。安装包文件位于 database/protein_domains_*。注释 ID/名称不匹配会导致无法标注，并可能产生警告。

WGS 结构变异#

-d 可接收同一样本 WGS 检出的结构变异，辅助弱表达融合并降低低置信度 RNA 候选的误报；结果可填充 closest_genomic_breakpoint1/2。Arriba 不应用于直接分析 DNA/WGS。

支持四列 TSV（两断点 CONTIG:POSITION，再加两个方向，方向可用 downstream/+、upstream/-）或结构变异 VCF。VCF 的 INFO 必须有 SVTYPE（BND、DEL、DUP、INV）；非 BND 还需 END。单断点变异会被忽略。-D 设置 RNA 与 DNA 断点允许的最大距离，默认 100,000 bp；基因内会扩展到基因边界，基因间按距离阈值判断。若变异来自覆盖不完整的 WES，应考虑关闭 no_genomic_support 过滤器，避免因漏检 DNA 变异而压掉 RNA 候选。

05 Output files#

`fusions.tsv`#

由 -o 指定，含通过全部过滤的预测，按置信度由高到低排列。重要列如下：

列	含义
`gene1`, `gene2`	融合转录本 5’、3’ 端基因；同一基因可表示基因内事件。基因间断点显示上下游最近基因及距离。
`strand1/2(gene/fusion)`	斜线前为注释基因链，斜线后为推测的转录链；不一致可表示反义转录，未知为 `.`。
`breakpoint1/2`	两侧转录本断点坐标。只有 discordant mates 时，坐标是最接近真实断点的 mate 位置估计。
`site1/2`	断点位置：`5'UTR`、`3'UTR`、`UTR`、`CDS`、`exon`、`intron`、`intergenic`；外显子边界会追加 `splice-site`。
`type`	`translocation`、`duplication`、`inversion`、`deletion`，或 `5'-5'`、`3'-3'`。附加标签可能包括 `read-through`、`non-canonical-splicing`、`ITD`。
`split_reads1/2`	以对应基因为 anchor 的 split fragments 数；较长的比对片段定义为 anchor。
`discordant_mates`	支持融合的 discordant mate pairs/fragments 数。
`coverage1/2`	断点保留侧附近覆盖度，计入所有 fragments（含重复）；支持 reads 列只计通过过滤的 reads。
`confidence`	`low`、`medium`、`high`，由支持数、证据平衡、断点距离、事件类型、基因内外位置及不同转录本等因素综合评定。
`reading_frame`	3’ 基因融合后是否 `in-frame` 或 `out-of-frame`；`stop-codon` 表示融合前已有终止密码子；不可预测为 `.`。
`tags`	`-t` 匹配到的自定义标签，多个以逗号分隔。
`retained_protein_domains`	`-p` 提供注释时，列出保留结构域及保留比例；两融合基因以竖线字符分隔。
`closest_genomic_breakpoint1/2`	`-d` 提供 WGS 变异时，列出最近基因组断点及 RNA/DNA 断点距离。
`gene_id1/2`, `transcript_id1/2`	GTF 基因 ID，以及与 reads 剪接模式最匹配的融合转录本 isoform。
`direction1/2`	`downstream` 表示融合 partner 接在断点坐标下游，通常对应 right-clipped；`upstream` 表示上游，通常 left-clipped。
`filters`	被过滤的支持 reads 类型及数量；可据此还原被丢弃 reads。
`fusion_transcript`	由高表达支持转录本组装的融合序列；竖线字符表示断点，小写字母可表示非模板碱基或参考错配，`[...]` 插入，`-` 删除，`___` 内含子，`?` 不确定，`...` 覆盖不足。启用 `-I` 时参考序列补片以括号表示，完整序列两端以 `^`、`$` 标记。
`peptide_sequence`	由融合转录本翻译的肽序列，竖线字符表示断点；小写字符可表示跨断点密码子、非编码区、插入/变异等。不可预测时为 `.`。
`read_identifiers`	支持 reads 名称列表。

基因方向与融合转录方向不要混为一谈；基因注释链和实际转录链可能不同。read-through 常提示邻近基因转录读穿，non-canonical-splicing 常提示环状 RNA；这类标签是风险提示，不代表一定是假阳性。

`fusions.discarded.tsv`#

由 -O 指定，含被判定为伪影或健康组织常见事件的候选，格式与 fusions.tsv 相同。用于检查预期事件是否被过滤。为节省时间和空间，默认不填弃置结果中的融合转录本、肽序列和 read 名；加 -X 才输出这些详细信息。

06 Visualization#

绘制融合图#

draw_fusions.R 为每个预测生成一页 PDF，展示融合基因方向、保留外显子、支持 reads 数及（若有）断点附近序列，也可绘制 ideogram、circos、结构域和覆盖度面板。

需要 R。可选依赖：circlize、Bioconductor GenomicRanges、GenomicAlignments。覆盖度需要 samtools，以及坐标排序并建立索引的 STAR 正常比对 BAM。

1
install.packages("circlize")
2
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager")
3
BiocManager::install(c("GenomicRanges", "GenomicAlignments"))

1
draw_fusions.R \
2
  --fusions=fusions.tsv \
3
  --alignments=Aligned.sortedByCoord.out.bam \
4
  --output=fusions.pdf \
5
  --annotation=GENCODE.gtf \
6
  --cytobands=database/cytobands_hg38.tsv \
7
  --proteinDomains=database/protein_domains_hg38.gff3

Bioconda 安装时，脚本可直接从 PATH 调用，数据库一般在 $CONDA_PREFIX/var/lib/arriba。Docker/Singularity 运行时需挂载输出目录、参考目录、融合表和可选 BAM/索引；镜像示例见 Visualization wiki。

IGV 检查#

在 IGV 中检查 Aligned.out.bam 和（旧式 STAR 输出时）Chimeric.out.sam 可帮助识别比对伪影。载入 IGV 前 BAM 需要坐标排序并索引。可把两个断点坐标以空格分隔粘贴到位置栏并排查看，再用 read_identifiers 中的名字通过右键 Select by name... 高亮支持 reads。若支持 reads 有大量错配或软剪切，可在 IGV 对 read 使用 Blat read sequence 搜索 STAR 可能漏掉的替代比对。

07 Command line options#

`arriba`#

1
arriba [-c Chimeric.out.sam] -x Aligned.out.sam \
2
  -g annotation.gtf -a assembly.fa \
3
  [-b blacklist.tsv] [-k known_fusions.tsv] [-d variants.tsv] \
4
  [-t tags.tsv] [-p protein_domains.gff3] \
5
  -o fusions.tsv [-O fusions.discarded.tsv] [OPTIONS]

参数	用途与默认值/说明
`-x FILE`	STAR 主比对 SAM/BAM/CRAM，必需。
`-c FILE`	STAR 独立嵌合比对文件；仅 `SeparateSAMold` 需要。
`-g FILE`	GTF 注释，必需。
`-G FEATURES`	指定 GTF 属性名称，适配不同来源字段。默认 `gene_name=gene_name\|gene_id gene_id=gene_id transcript_id=transcript_id feature_exon=exon feature_CDS=CDS`。同一属性的替代名用竖线字符分隔。
`-a FILE`	FASTA 参考基因组，必需；CRAM 需要 `.fai`。
`-b FILE`	blacklist；强烈建议提供。
`-k FILE`	已知融合清单，提高指定融合灵敏度。
`-o FILE`	通过过滤的融合结果，必需。
`-O FILE`	被过滤候选结果。
`-t FILE`	自定义融合标签表。
`-p FILE`	蛋白结构域 GFF3。
`-d FILE`	WGS 结构变异 TSV/VCF。
`-D DISTANCE`	RNA 与 WGS 断点允许距离；默认 `100000`。
`-s MODE`	链特异性：`auto` 自动判断（默认）、`yes` read1 链同转录链、`reverse` read1 链反向、`no` 非链特异。
`-i CONTIGS`	感兴趣 contig；其他 contig 融合忽略。支持 `chr` 前缀和 `` 通配。默认 `1-22 X Y AC_ NC_*`。
`-v CONTIGS`	病毒 contig 列表，用于整合位点；默认 `AC_* NC_*`。
`-f FILTERS`	关闭指定过滤器，逗号/空格分隔；默认全开。名称见下方过滤器说明。
`-E VALUE`	`relative_support` e-value 阈值；默认 `0.3`。增大可提高灵敏度但可能明显增加假阳性和运行时间。
`-S READS`	最少支持 reads；默认 `2`。
`-m FRACTION`	错误比对支持 reads 的最大比例；默认 `0.8`。
`-L IDENTITY`	判定同源基因的最大序列相似度；默认 `0.3`。
`-H LENGTH`	邻近 homopolymer 过滤长度；默认 `6`。
`-R DISTANCE`	read-through 距离阈值；默认 `10000` bp。
`-A LENGTH`	`short_anchor` 最短 anchor；默认 `23` bp。
`-M COUNT`	`many_spliced` 救回事件所需剪接断点数；默认 `4`。
`-K FRACTION`	低复杂度过滤的 3-mer 最大占比；默认 `0.6`。
`-V PVALUE`	mismatch 过滤 p 值阈值；默认 `0.01`。
`-F LENGTH`	单端数据片段长度假设；默认 `200`。双端数据自动估计，此参数无效。
`-U COUNT`	单事件支持 reads 超过此数时抽样；默认 `300`，降低资源占用但超出部分计数不准确。
`-Q QUANTILE`	`in_vitro` 过滤高表达基因分位数；默认 `0.998`。
`-e FRACTION`	基因内事件外显子比例阈值；默认 `0.33`。
`-T COUNT`	最多报告表达量最高的病毒 contig 的整合事件数；默认 `5`。
`-C FRACTION`	病毒 contig 最低覆盖比例；默认 `0.05`。
`-l LENGTH`	ITD 最大搜索长度；默认 `100` bp。增大可能降低性能并引入未被 blacklist 训练覆盖的胚系伪阳性。
`-z FRACTION`	ITD 最小支持等位比例；默认 `0.07`。
`-Z COUNT`	ITD 最少支持 reads；默认 `10`。
`-@ THREADS`	BAM/CRAM 读取线程数；后续过滤不并行。通常 1 线程已足够，超过 2 线程通常无益。
`-u`	关闭内部重复标记，改用 BAM 的 `BAM_FDUP` 标记；UMI 或合并多个 library 时应考虑使用。
`-X`	在 `-O` 弃置候选表中也输出序列、肽段、read 名等详细列。
`-I`	尽可能用参考序列填充不完整融合转录本，并扩展至转录本边界；可能掩盖少数与参考不一致的真实细节。
`-h`	打印帮助并退出。

-f 可关闭的过滤器为：top_expressed_viral_contigs、viral_contigs、low_coverage_viral_contigs、uninteresting_contigs、no_genomic_support、short_anchor、select_best、many_spliced、long_gap、merge_adjacent、hairpin、small_insert_size、same_gene、genomic_support、read_through、no_coverage、mismatches、homopolymer、low_entropy、multimappers、inconsistently_clipped、duplicates、homologs、blacklist、mismappers、spliced、relative_support、min_support、known_fusions、end_to_end、non_coding_neighbors、isoforms、intronic、in_vitro、intragenic_exonic、internal_tandem_duplication。关闭过滤器会改变灵敏度/特异性，应保留参数记录并检查弃置结果。

`draw_fusions.R` 参数#

1
draw_fusions.R --fusions=fusions.tsv --annotation=annotation.gtf --output=output.pdf \
2
  [--alignments=Aligned.sortedByCoord.out.bam] \
3
  [--cytobands=cytobands.tsv] [--proteinDomains=protein_domains.gff3]

常用选项：--fusions 接 Arriba 或 STAR-Fusion 表；--annotation GTF；--output PDF；--cytobands 绘制染色体 ideogram/circos 所需带型表；--alignments 坐标排序并索引的 STAR 正常比对 BAM，绘制 coverage；--proteinDomains 绘制保留结构域。其它控制项：--mergeDomainsOverlappingBy（默认 0.9）、--optimizeDomainColors（FALSE）、--sampleName、--minConfidenceForCircosPlot（默认 medium）、--pdfWidth（11.692 英寸）、--pdfHeight（8.267 英寸）、--squishIntrons（TRUE）、--color1（#e5a5a5）、--color2（#a7c4e5）、--printExonLabels（TRUE）、--render3dEffect（TRUE）、--plotPanels（默认 fusion,circos,domains,readcounts）、--fontSize（1）、--fontFamily（Helvetica）、--showIntergenicVicinity（默认 0）、--transcriptSelection（provided、coverage 或 canonical）、--fixedScale（0 自动缩放）、--coverageRange（默认 0，按峰值同尺度）。各选项的细节见命令行选项 Wiki。

08 Interpretation of results#

置信度代表什么#

置信度描述转录本是否异常（健康组织中少见）、是否可能由基因组重排解释、是否不像伪影；它不代表致癌能力。高置信度乘客事件也可能不具肿瘤生物学作用。结果按整体可信度排序，支持 read 数影响很大，但断点位置、背景噪声、事件类型和多个转录本等也参与判定。Wiki 所述内部评估中，高/中/低置信度与基因组重排的相关比例约为三分之二、三分之一和 5–10%；这是下限估计，不能代替验证。

低置信度一般应谨慎，除非有同癌种已知事件、配对肿瘤 WGS 结构变异、或同一肿瘤的独立转移灶 RNA-seq 等证据支持。低肿瘤纯度或低文库复杂度场景可能需要更关注灵敏度。

激活型与失活型融合#

激活型融合（常涉及 oncogene）往往支持 reads 较多、融合转录本表达升高、转录链与编码链一致，并常保留开放阅读框和关键蛋白结构域。检查 strand1/2、reading_frame、断点是否位于剪接位点，以及 retained_protein_domains；受体酪氨酸激酶融合通常应确认激酶结构域是否保留。TCR/免疫球蛋白相关增强子劫持是例外，断点可能处于基因间区。失活型融合常涉及抑癌基因，未必需要保持阅读框，断点可在基因任意位置，也可能涉及反义链或基因间区域，并因表达低而置信度偏低。

支持证据的读法#

10 条支持 reads 在许多场景下较有说服力，但阈值依表达量、可比对性和事件类型变化；真实融合也可能只有 2–5 条支持 reads。若高表达基因仅有极少融合 reads，要谨慎。通常真实事件的 split_reads1、split_reads2、discordant_mates 中至少两个非零且相对平衡；只有一种证据且达到 5 条以上值得复核。支持 reads 通常至少占断点 coverage 的约 1%。这些是经验线索，不是硬性诊断标准。检查 filters 了解被排除证据；注意 coverage 包含重复 reads，而支持数排除了重复，并可能受 -U 抽样影响，两者并不严格可比。

常见假阳性#

Read-through：邻近同链基因发生转录读穿，健康组织中也可见。Arriba 以 blacklist 过滤但不能完全排除；结果可能带 read-through 或 deletion/read-through 标记。结合表达、WGS/CNV 缺失和同区域多个事件判断。
环状 RNA：RNA-seq 中常表现为基因内、两端在剪接位点的 duplication，结果可能带 non-canonical-splicing。无 WGS 时难区分真实基因组 duplication。
体外建库伪影：高表达基因（血红蛋白、纤维蛋白原、胶原等）逆转录时模板切换形成嵌合分子。常见特征为 split reads 少、discordant mates 多、许多高表达基因互相成网、断点落在外显子内部而非剪接边界。
ITD：FLT3、BCOR、EGFR、ERBB2 等 ITD 可是驱动事件，但胚系 ITD 也存在；无正常对照时难以判断体细胞/胚系，查看 type 中 ITD 标记并用其他证据确认。
已知融合表救回事件：-k 可能救回支持较弱的事件；其低置信度标记应结合独立证据评估。

09 Utility scripts#

Arriba 的 scripts 目录提供小型辅助脚本：

脚本	用法	作用与注意事项
`extract_fusion-supporting_alignments.sh`	`extract_fusion-supporting_alignments.sh fusions.tsv Aligned.sortedByCoord.out.bam prefix`	按 `read_identifiers` 从已排序、已索引 BAM 提取每个融合的支持比对；每个事件生成独立 mini-BAM，文件名带结果排名。
`convert_fusions_to_vcf.sh`	`convert_fusions_to_vcf.sh assembly.fa fusions.tsv output.vcf`	将 Arriba TSV 转为 VCF 4.3；缺少 FASTA `.fai` 时自动建立。
`run_arriba_on_prealigned_bam.sh`	`run_arriba_on_prealigned_bam.sh STAR_genomeDir annotation.gtf assembly.fa blacklist.tsv known_fusions.tsv protein_domains.gff3 threads alignments.bam`	仅重比对未比对和 clipped reads，旧 aligner 或旧 STAR BAM 可省时间。需要参考坐标相容；与全量重新比对结果可能略有差异，最高准确度仍建议按主流程全量比对。已按推荐流程生成的 BAM 不需要此脚本。
`quantify_virus_expression.sh`	`quantify_virus_expression.sh alignments.bam virus_expression.tsv`	统计映射到 `AC_`/`NC_` 病毒 contig 的高质量 reads；要求无重复、多重比对、完整 read 比对，双端数据还要求 proper pair。相近病毒株只报告最高表达株；至少表达病毒基因组 5% 且 100 bp 才报告。BAM 有索引时更快。
`annotate_exon_numbers.sh`	`annotate_exon_numbers.sh fusions.tsv annotation.gtf output.tsv`	按 `transcript_id1/2` 对断点补充 `exon_number1/2` 两列。

10 Current limitations#

Arriba 可检出基因内 inversion 和 duplication，但不报告基因内 deletion，因为 RNA-seq 中难以与正常剪接区分；此类问题应使用 indel caller、WGS 或差异外显子表达分析。
官方支持人类 hg19/GRCh37、hg38/GRCh38，以及小鼠 mm10/GRCm38、mm39/GRCm39。其他物种理论上可运行，但缺少训练好的 blacklist、已知融合和蛋白结构域等参考，结果准确度与注释完整度较低。
常见内存量低于 10 GB；粗略约每百万嵌合 read pairs 增加 1 GB，另有约 4 GB 静态开销。异常高内存先检查 STAR Log.final.out 中 % of chimeric reads，排查 FASTQ mate 顺序错误或 read 未按名称配对/整理；骨髓瘤等免疫球蛋白重排丰富样本可自然偏高。-U 默认每事件 300 条后抽样。
多数情况下无需接头修剪，STAR 可部分剪切比对；若 Log.final.out 的 % of reads unmapped: too short 偏高且 reads 含大量接头，可考虑 --clip3pAdapterSeq 或修剪工具，以改善融合灵敏度。
病毒检测范围取决于 STAR index 和组装中包含的病毒。Arriba download_references.sh 生成的参考包括大量 RefSeq 病毒及相关人感染株；额外病毒需自行加入序列并重建 STAR index。相近病毒株可能被错分，载体序列也可能被报告为相似病毒整合。
靶向 panel 的局部超深覆盖不符合 Arriba 背景模型，假阳性更高，尤其邻近基因 read-through；低置信度结果应更谨慎。可考虑额外要求支持 reads 至少达到 coverage 总和的 1%，并对使用 UMI 的样本先按 UMI 外部去重，再以 -u 运行。
支持数和 coverage 的计数口径不同：支持数为通过过滤的非重复 reads，且默认可抽样；coverage 包括重复且不经过相同过滤。想要口径接近，需在运行 Arriba 前从 BAM 中移除（不是只标记）重复 reads。
其他 aligner 原则上可用，但必须按 SAM 规范表示 split reads 和 discordant mates：supplementary alignment 要正确设置 0x800 与 SA 标签，discordant mate 不得标 proper pair。当前多于一个 supplementary alignment 的 read 会被忽略；多重嵌合比对需记录一致的 HI 标签。

11 Internal algorithm#

STAR 负责产生融合候选，Arriba 主要是一组过滤器：read-level 过滤器先检查单个 read/pair，再由 event-level 过滤器综合多个 reads。所有过滤器默认开启；-f 可按名关闭。输出 filters 列记录过滤事件或支持 reads 的过滤器及数量，过滤顺序也可帮助追踪候选如何被处理。

Read-level filters#

过滤器	作用
`duplicates`	默认按片段两端坐标内部标重复，不使用 BAM read group 的 library (`LB`) 区分；`-u` 改为依赖 BAM `BAM_FDUP` 外部标记，适合 UMI 或多 library 合并。
`uninteresting_contigs`	去掉非主要染色体、decoy/未组装 contig 事件；可用 `-i` 指定感兴趣 contig。
`viral_contigs`、`top_expressed_viral_contigs`、`low_coverage_viral_contigs`	分别筛病毒与宿主融合、限制到表达最高的病毒 contig（`-T`）、移除覆盖过于局部且全 contig 覆盖不足的病毒候选（`-C`）。
`read_through`	去除靠近基因、方向符合正常剪接的 mates；默认 `-R 10 kb`。会牺牲部分靠近基因末端的小缺失检测。
`inconsistently_clipped`	当两端都跨断点时，若只有一条 mate 被剪切、另一条还能匹配参考至少 3 bp，则认为剪切可疑并去除。
`homopolymer`	去掉断点邻近长同聚物的候选，默认长度阈值 `-H 6`。
`small_insert_size`	去除几乎完全重叠、方向像 duplication 的极短插入片段伪影。
`long_gap`	去除极长 gap（>700 kb）却靠很短片段（<15 nt）比对的可疑 alignment。
`same_gene`	去掉同一基因内、方向可由正常剪接解释的 mate pair。
`hairpin`	去除转录距离小于平均片段长度加 3 个标准差的候选，降低建库/测序中分子折返伪影；单端默认片段长度由 `-F`（默认 200）给定。
`mismatches`	用假设测序错误率 1% 的二项模型移除错配过多的 reads，阈值由 `-V` 控制。
`low_entropy`	3-mer 过度重复的 reads 视为低复杂度，默认任一 3-mer 占比达 60%（`-K`）即过滤。

Event-level filters#

过滤器	作用
`multimappers`	多重比对保留最佳分数；同分时优先归入支持数最多的融合候选。
`merge_adjacent`	将相距 5 bp 内的重复断点合并到支持最多者。
`non_coding_neighbors`	去除相邻、注释不完善的非编码基因之间容易误注释成 deletion 的事件。
`intragenic_exonic`	去除基因内两断点都在外显子、但间隔主要为内含子的可疑事件；比例由 `-e` 控制。
`min_support`	支持 reads 少于 `-S`（默认 2）时过滤。
`relative_support`	根据基因整体嵌合噪声估计随机出现该支持数的 e-value；`-E` 默认 0.3，调高会增加灵敏度也降低特异性。
`internal_tandem_duplication`	对同一外显子内的 ITD 候选严格过滤，但支持极强时可救回；最大长度由 `-l` 控制。
`intronic`	若所有证据都在内含子/基因间区域且无 reads 覆盖外显子，则过滤。
`known_fusions`	用 `-k` 清单救回支持偏少但无其他明显伪影的已知融合。
`in_vitro`	识别高表达基因、外显子内部断点异常多、split/discordant 证据失衡的体外模板切换伪影。
`spliced`、`many_spliced`	若两端在剪接位点且同一基因对还有其它候选，或同一基因对出现多个剪接事件，可救回因支持不足被过滤的候选。
`select_best`	同一基因对有多个断点时优先保留 split reads 两侧都有、证据更多且更可信者。
`marginal_read_through`	进一步区分读穿与局部缺失：邻近同链基因、断点落在两个基因边缘的候选更可能是 read-through。
`no_genomic_support`	若提供 WGS 变异（`-d`），可过滤未获基因组证据支持的低置信度事件。
`blacklist`	去除与 blacklist 断点匹配的候选；只有 discordant mates 时会按片段长度范围匹配。
`short_anchor`	若 split reads 在一侧基因只有很短累计比对片段，视为错配风险；阈值 `-A` 默认 23 bp。
`end_to_end`	两融合端都只保留 3’ 末端通常缺失启动子，多数可疑；除非 split reads 两侧均有或兼有 discordant mates 等强证据。
`no_coverage`	对内含子/基因内或 read-through 断点，若正常（非嵌合）比对在附近没有覆盖，提示 alignment artifact。

其余过滤器名单也可在命令行参数说明查询。实际审查时先检查支持 reads、断点和 coverage，再看 filters、type 附加标签及置信度；任何单个阈值都不应代替生物学背景和独立数据验证。