1. 目的#

为了缩短流程测试时间、降低计算资源消耗，可以从完整的双端测序数据中随机抽取一定比例的 reads，生成较小规模的测试数据集。

本例使用 seqkit sample 从双端 FASTQ 数据中抽取约 10% 的 read pairs，并使用固定随机种子保证结果可重复。

原始数据：

1
SRR10129631_1.fastq.gz
2
SRR10129631_2.fastq.gz

降采样结果：

1
SRR10129631_ds10_raw_1.fq.gz
2
SRR10129631_ds10_raw_2.fq.gz

其中，ds10 表示 downsample 10%。

2. 双端 FASTQ 降采样的关键原则#

双端测序数据中的 R1 和 R2 必须保持一一对应。因此，不能分别使用不同的随机条件对两个文件进行抽样。

SeqKit 官方文档指出，对双端 FASTQ 文件进行抽样时，应当为 R1 和 R2 使用相同的随机种子，从而抽取相同位置的 read pairs。

本例统一使用：

1
-p 0.1
2
-s 42

参数含义：

• -p 0.1：随机保留约 10% 的 reads。
• -s 42：设置随机种子为 42。
• R1 和 R2 使用完全相同的比例和随机种子。

固定随机种子后，在输入文件不变的情况下，可以重复获得相同的抽样结果。

需要注意，使用这种方法的前提是：

1. 原始 R1 和 R2 的记录数量相同。
2. R1 和 R2 中的 reads 顺序严格对应。
3. 两次执行 seqkit sample 时使用相同参数和随机种子。

3. 本次使用的目录结构#

输入目录：

1
/Volumes/WD_BLACK/data/WGS_HEK293T/rawdata

输出目录：

1
/Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata

参考文件目录：

1
/Volumes/WD_BLACK/data/011/ref

降采样目录通过软链接复用该参考文件：

1
/Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/ref
2
    -> /Volumes/WD_BLACK/data/011/ref

4. 完整命令#

1
mkdir -p /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata
2

3
seqkit sample \
4
    -p 0.1 \
5
    -s 42 \
6
    /Volumes/WD_BLACK/data/WGS_HEK293T/rawdata/SRR10129631_1.fastq.gz |
7
    gzip > /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata/SRR10129631_ds10_raw_1.fq.gz
8

9
seqkit sample \
10
    -p 0.1 \
11
    -s 42 \
12
    /Volumes/WD_BLACK/data/WGS_HEK293T/rawdata/SRR10129631_2.fastq.gz |
13
    gzip > /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata/SRR10129631_ds10_raw_2.fq.gz
14

15
ln -sfn \
16
    /Volumes/WD_BLACK/data/011/ref \
17
    /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/ref
18

19
ls -lh /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata

5. 使用变量和循环的推荐写法#

当样本名称或目录较长时，可以使用变量减少重复：

1
#!/usr/bin/env bash
2

3
set -euo pipefail
4

5
src_dir="/Volumes/WD_BLACK/data/WGS_HEK293T/rawdata"
6
dst_dir="/Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled"
7
ref_dir="/Volumes/WD_BLACK/data/011/ref"
8

9
accession="SRR10129631"
10
proportion="0.1"
11
seed="42"
12

13
mkdir -p "${dst_dir}/rawdata"
14

15
for read in 1 2; do
16
    seqkit sample \
17
        -p "${proportion}" \
18
        -s "${seed}" \
19
        "${src_dir}/${accession}_${read}.fastq.gz" |
20
        gzip > "${dst_dir}/rawdata/${accession}_ds10_raw_${read}.fq.gz"
21
done
22

23
ln -sfn "${ref_dir}" "${dst_dir}/ref"
24

25
ls -lh "${dst_dir}/rawdata"

6. 检查原始双端数据#

降采样前，应首先检查 R1 和 R2 的记录数是否一致：

1
seqkit stats \
2
    /Volumes/WD_BLACK/data/WGS_HEK293T/rawdata/SRR10129631_1.fastq.gz \
3
    /Volumes/WD_BLACK/data/WGS_HEK293T/rawdata/SRR10129631_2.fastq.gz

正常情况下，两个文件的 num_seqs 应完全相同。

如果原始 R1 和 R2 已经发生错位，即使使用相同随机种子，降采样后也无法恢复正确的配对关系。

7. 检查降采样结果#

1
seqkit stats \
2
    /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata/SRR10129631_ds10_raw_1.fq.gz \
3
    /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata/SRR10129631_ds10_raw_2.fq.gz

1
gzip -t \
2
    /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata/SRR10129631_ds10_raw_1.fq.gz \
3
    /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata/SRR10129631_ds10_raw_2.fq.gz

1
r1="/Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata/SRR10129631_ds10_raw_1.fq.gz"
2
r2="/Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata/SRR10129631_ds10_raw_2.fq.gz"
3

4
seqkit seq -n -i "${r1}" |
5
    sed -E 's#/([12])$##' > /tmp/downsampled_r1.ids
6

7
seqkit seq -n -i "${r2}" |
8
    sed -E 's#/([12])$##' > /tmp/downsampled_r2.ids
9

10
cmp /tmp/downsampled_r1.ids /tmp/downsampled_r2.ids

1
rm -f /tmp/downsampled_r1.ids /tmp/downsampled_r2.ids

8. 使用 pigz 加速压缩#

普通 gzip 通常只使用单线程。如果数据量较大且已安装 pigz，可以改成：

1
THREADS=16
2

3
seqkit sample \
4
    -p 0.1 \
5
    -s 42 \
6
    /Volumes/WD_BLACK/data/WGS_HEK293T/rawdata/SRR10129631_1.fastq.gz |
7
    pigz -p "${THREADS}" \
8
    > /Volumes/WD_BLACK/data/input_downsampled/rawdata/SRR10129631_ds10_raw_1.fq.gz

R2 使用相同参数处理即可。

9. 方法总结#

本次降采样使用 seqkit sample，分别对 R1 和 R2 抽取约 10% 的 reads。

核心参数为：

1
-p 0.1 -s 42

其中，相同的随机种子用于保证 R1 和 R2 抽取相同位置的 records。降采样后需要检查：

1. R1 和 R2 的序列数量是否一致。
2. R1 和 R2 的 read ID 是否一一对应。
3. 输出 gzip 文件是否完整。
4. 实际抽样比例是否接近预期值。

最终生成的双端降采样数据可以用于流程调试、参数测试和快速运行，但不应直接替代完整数据进行最终定量分析。